Western Blotting 内参抗体的选择

       在 Western Blotting 中使用内参，就是在试验中用内参对应的抗体检测内参蛋白。内参 就是内部参照，一般是指管家基因编码表达的蛋白，它们在各个组织和细胞中的表达相对恒 定，常用在检测蛋白的表达水平变化时做参照。

       利用 Western Blotting 可比较在组织细胞蛋白上样等量时，不同条件或不同组织细胞中 目的蛋白的表达量，特别是当目的蛋白表达量不高时，上样量的的差别就极可能影响结果的 分析。因此，在 Western Blotting 试验中，进行内参的检测，可以校正蛋白质定量、上样过 程中存在的误差，保证实验结果的准确性；此外，内参可作为空白对照，检测蛋白转膜是否 完全、整个 Western Blotting 显色发光体系是否正常。目前，在国内外发表的文章中，Western Blotting 作内参校正已成为一种惯例。

       内参抗体种类很多，比如 β-Actin、β-Tubulin、GAPDH、Lamin B、PCNA、Na+/K+ ATPase 等，下面简单介绍下选择内参抗体应遵循的原则：

一． 样本种属来源

       首先要考虑的就是实验样本来源于什么物种。

       哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择 β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、PCNA、 Na+/K+-ATPase 等。

       植物来源实验样本，则可以选择 Plant actin、Rubisco 等。

       其他来源样本研究较少，所以就应该参照文献报导，选择合适的蛋白作为内参。

二． 目的蛋白分子量

       选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋 白分子量相差5KD以上。比如检测目的蛋白分子量为45KD，此时不适宜选择β-actin（42KD） 作为内参，可以考虑选择 GAPDH（36KD）作为内参。

三． 目的蛋白表达部位

       胞浆和全细胞蛋白: β-actin、GAPDH、β-Tubulin 等

       胞核蛋白：PCNA 等

       核膜蛋白：Lamin B 等

       胞膜蛋白：Na+/K+-ATPase 等

       线粒体蛋白：COX IV、VDAC1 等

       以上几条原则只是针对通常情况，但是需要注意的问题是——内参的选择需要考虑实 际的试验环境。比如某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致 GAPDH 的表达增 高，不适合做内参；比如在在凋亡实验时，Lamin 等也不适合作为内参。因此设计实验方案 的时候应该考虑这些因素并查询相应文献，也应该注意内参表达出现异常。

四． 博士德生物提供了多种内参蛋白抗体,帮助客户选择最合适的内参蛋白抗体。

       β-Actin

       Actin 即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin 大致可分为六种，其中四种是不 同肌肉组织特异性的，其余两种广泛分布于各种组织中，包括 β-actin 和 γ-non-muscle actin。 针对大多数组织和细胞来说的，β-actin 作为内参是公认的，它由375个氨基酸组成，分子量 大小为42KD 左右，广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富，其含量占所有细胞总蛋白的50%。 但是在某些特殊的情况下，如脂肪组织或细胞内，β-Actin 的表达量就很少。

       实验图例：

       Tubulin

       Tubulin 即微管蛋白，是细胞的一种骨架蛋白。Tubulin 分为 α、β、γ、δ、ε 等多种 tubulin， 其中 α-Tubulin 和 β-Tubulin 可以形成异源二聚体，也是形成微管的最主要的两种 Tubulin。 α-tubulin 和 β-tubulin 分子量分别为55kDa 和50kDa，其实际检测条带均在55kDa 左右。作 为内参，β-tubulin 的蛋白水平通常不会发生改变，因此被广泛用于 Western Blotting，其作 为上样量是否一致的参照，也常被用于免疫染色，观察细胞的微管结构。

       实验图例：

       GAPDH

       GAPDH 即甘油醛-3-磷酸脱氢酶，是参与糖酵解的一种关键酶，催化糖酵解的第六步, 它还参与核转录、DNA 复制和修复以及细胞凋亡等。它由4个30-40kDa 的亚基组成，分子 量146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH 基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛 用作 Western Blotting 的内参。但请注意,某些生理因素,如缺氧和糖尿病,会增加 GAPDH 在 特定的细胞和组织的表达。

       实验图例：

       PCNA

       PCNA 即增殖细胞核抗原，因其只存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内而得名，以后的研 究发现 PCNA 与细胞 DNA 合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增 殖状态的良好指标。它在细胞核内合成，并存在于细胞核内，由261个氨基酸组成，分子量 为29KD。

       实验图例：

       Lamin B

       Lamin B 即核纤层蛋白 B, 是凋亡关键因素 Caspase 家族的作用靶子，受 Caspase 的 剪切而活化，位于核膜。其由 586 个氨基酸组成，分子量为 66KD。

       实验图例：

       Na+/K+-ATPase

       Na+/K+-ATPase 即 Na+/K+-ATP 酶或 Na+/K+-ATP 泵，它会使细胞外的 Na+浓度高于细 胞内，当 Na+顺着浓度差进入细胞时，会经由本体蛋白质的运载体将不易通过细胞膜的物 质以共同运输的方式带入细胞。其由 1023 个氨基酸组成，分子量为 113KD。

       实验图例：

博士德生物内参抗体及对应二抗抗体：