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| ■ 制品说明 |
| In-Fusion Snap Assembly是Takara推出的新一代无缝克隆试剂，延续了上一代HD系列产品的优点，仅通过15分钟反应，即可将1个或多个PCR片段按照设计要求插入到任意载体的任意位置，对于待克隆的PCR片段，不需要进行限制酶酶切、磷酸化及末端平滑化等处理。Snap Assembly系列的实验效率和一致性均超过HD系列产品，更擅长多片段克隆以及高通量实验。 |
| ■ 制品内容 |
| · 5X In-Fusion Snap Assembly Master Mix · linearized pUC19 Control Vector · 2 kb Control Insert |
| ※ PCR产物纯化需要另外准备纯化试剂，例如可使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0（Code No. 9762）纯化柱。 ※ 试剂盒中不附带感受态细胞，转化实验请使用高效率的感受态细胞，例如 E. coli HST08 Premium Competent Cells（Code No. 9128）或 Stellar感受态细胞。 ※ 扩增目的片段及对载体进行反向PCR时建议使用高保真酶 PrimeSTAR Max DNA Polymerase（Code No.：R045A/B）。 |
| ■ 制品特点 |
| · 可在任意载体的任意位置进行定向克隆 · 操作简单方便，无需进行反复的酶切连接 · 对于50 bp～15 kb的插入片段，克隆效率可超过95% · 与现有的In-Fusion HD Cloning Kit相比，多片段克隆效率大幅提升 · 在高正确率的基础上，转化后得到的菌落数比其他公司的同类产品更多 |
| ■ In-Fusion原理 |
| In-Fusion技术利用In-Fusion酶，通过识别DNA片段（例如PCR片段和线性化载体）末端15 bp的同源序列来实现高效、准确地融合。这15 bp的同源序列可在设计目的片段扩增引物时，使用我们的在线引物设计工具进行设计。In-Fusion酶从线性DNA链的3'末端切割核苷酸，这样，两个DNA片段之间便形成互补碱基对，可通过退火使片段连接起来。通过这一原理可将单个或多个片段克隆到载体中，而无需亚克隆。除此之外，In-Fusion技术还可以应用于突变导入、基因合成、特定基因结构域改变等。 |
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| 图1. In-Fusion克隆标准工作流程示意图（适用所有In-Fusion克隆试剂盒）。 |
| ■ In-Fusion引物设计 |
| In-Fusion克隆用引物的设计与目的片段PCR扩增用引物的设计基本相同。不同之处是需要在特异性引物的5'末端添加15个与载体末端序列相同的碱基（参考下图）。 |
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| ■ 对比实验例 |
| 实验例1 |
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| 图2. In-Fusion Snap Assembly和In-Fusion HD性能比较。分别使用In-Fusion Snap Assembly和In-Fusion HD将五个不同的插入片段（大小从405 bp到1,005 bp不等）同时克隆到一个经反向PCR线性化的2.7 kb的载体中，每组克隆反应重复三次。两个反应系统除了酶预混液不同之外，扩增引物和其他试剂全部相同。转化涂菌后显示Snap Assembly组长出的菌落数是HD组的4倍，挑取10个转化菌落，进一步使用Sanger测序法进行验证，结果显示二者正确率均超过90%。 |
| 实验例2 |
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| 数据来源于Takara Bio USA, Inc. |
| 图3. In-Fusion Snap Assembly与其他公司同类产品A的比较（使用反向PCR的方法线性化载体）。 将3.8 kb的片段（图A）或34.2 kb的腺病毒片段（图B）克隆到通过反向PCR线性化的2.7 kb的载体中，每组克隆反应重复三次。引物按照所使用试剂厂家的要求进行设计。 转化涂菌后显示In-Fusion Snap Assembly组长出的菌落数是A产品组的2倍，各挑取20个转化菌落，再使用Sanger测序法和菌落PCR的方法分别进行验证，结果显示In-Fusion Snap Assembly的正确率超过95%。 |
| 实验例3 |
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| 数据来源于Takara Bio USA, Inc. |
| 图4．In-Fusion Snap Assembly与其他公司同类产品A的比较（使用限制酶酶切的方法线性化载体）。将3.8 kb的片段克隆到通过限制酶酶切线性化的标准载体中，载体因使用不同的限制酶而产生三种不同末端，5'突出端（图A），平端（图B）和3'突出端（图C），每组克隆反应重复三次，引物按照所使用试剂厂家的要求进行设计。转化涂菌后显示In-Fusion Snap Assembly组长出的菌落数是A产品组的5-16倍，根据载体末端类型的不同而不同。各挑取20个转化菌落，进一步使用Sanger测序法进行验证，结果显示In-Fusion Snap Assembly的正确率超过95%。 |
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