产品说明

Tricine-SDS-聚丙烯酰胺制胶及电泳试剂盒（Tricine-SDS-PAGE）是目前电泳法变性分离多肽的主要方法，适用于低分子量蛋白（2.5-40 kD）蛋白的分离。此试剂盒可以制备20或50块 0.75 mm× 14 cm×14 cm 胶。对于大于5 kD的蛋白，无需制备隔离胶，双层胶足以分离。对于小于5 kDa的蛋白，需要制备3层胶才能较好的分离。推荐使用4%浓缩胶，10%隔离胶，16%分离胶作为标准浓度，可以分辨出1-5 kD的片段。Tricine-SDS-PAGE系统不同于常规的SDS-PAGE，使用两种缓冲液电泳，电泳槽内槽是1×阴极缓冲液，含有Tricine和SDS。外槽是1×阳极缓冲液，为0.2M Tris。

产品内容

注意：过硫酸铵（APS）为结晶性粉末，2-8 ℃储存，使用前每支加入1 mL蒸馏水即为10% APS溶液，现配现用最佳，溶液用后-20 ℃可储存2个月。APS如出现严重结块，即已变质。

操作步骤

（以足够灌两块0.75 mm× 14 cm×14 cm胶为例）

一、制胶

1. 标记3个50 mL三角瓶，按下表用量配制分离胶30 mL、隔离胶9 mL和浓缩胶9 mL。混匀后真空脱气10-15分钟。

2.在分离胶瓶中加入10% APS 150 μL 溶液和TEMED 30 μL，轻旋混匀。 

3.灌分离胶。用巴斯德吸管，将分离胶溶液沿着隔条边缘缓缓注入，直至距玻璃上沿约5 cm。由于分离胶比重比隔离胶大，故可在其凝固前直接灌隔离胶。 

4.在隔离胶瓶中加入10%的APS溶液75 μL和TEMED 15 μL，轻轻旋转混匀。 

5.灌隔离胶。用巴斯德吸管，将隔离胶溶液沿着隔条边缘缓缓注入，直至距玻璃板上沿约3 cm。

6.加入1 cm高的水饱和异丁醇封胶。室温放置30-45分钟。（氧气会抑制胶凝固；水饱和异丁醇可用水代替，但效果会差一些）。

7.在浓缩胶瓶中加入10% APS溶液75 μL和TEMED 15 μL，轻轻旋转混匀。

8.灌浓缩胶。用巴斯德吸管，将浓缩胶沿着隔条边缘缓缓注入，直至距玻璃板上沿约1 cm 。 

9.插入0.75 mm厚梳子，补加浓缩胶溶液填满梳子间的空隙，通过抽真空或者吸水滤纸去除气泡。静置30-45分钟确认凝胶后小心拔出梳子。

二、加入电泳缓冲液

1. 在上层缓冲液槽中加入1× 阴极缓冲液，并用1× 阴极缓冲液冲洗加样孔。

注：10× Tricine-SDS-PAGE阴极缓冲液用去离子水1:9稀释成 1×阴极缓冲液。

2.在下层缓冲液槽中加入1× 阳极缓冲液。

注：10×Tricine-SDS-PAGE阳极缓冲液用去离子水1:9稀释成 1× 阳极缓冲液。

三、上样

1. 处理样品。如样品是蛋白沉淀物，则加入50-100 μL 新配的1×上样缓冲液溶解。如果样品是蛋白稀溶液，则需先浓缩蛋白，再与2× Tricine多肽上样液按1: 1混合。

2. 100 ℃煮沸3-5分钟灭活蛋白酶；膜蛋白则需37℃孵育15-60 min。

注意：与上样缓冲液混合后的样品如未经灭活蛋白酶，切勿室温放置。

3. 上样。如需考染，复杂蛋白样品建议上样量20 μL（含25-50 μg 总蛋白）；含一种或几种蛋白的样品， 建议上样量1-10 μL。如需银染，上样量可相应减少10-100倍。

四、电泳

1. 电泳。首先30 V 恒压电泳1 h， 然后150 V恒压电泳4-5 h。

注：上样液以考马斯亮蓝G-250为指示剂，其迁移速度要快于最小的肽。

2. 终止电泳，取出凝胶进行后续的实验（建议银染染色，节约样品）。 

注意：考染或银染时，尽可能采用快速染色方法，否则多肽有可能会扩散出PAGE胶而降低检测的灵敏度。