产品说明

Coolaber出品的经典酵母转化试剂盒主要用于酿酒酵母质粒转化实验，该试剂盒遵循广大用户的使用习惯，分别提供PEG、LiAc和Carrier DNA溶液，PEG、LiAc均经过滤除菌，Carrier DNA经特殊优化处理，更有助于提高质粒DNA的转化效率。该试剂盒可根据实际需要灵活配制1 × LiAc溶液和转化预混液，既方便使用，又经济实惠。

储存条件

Carrier DNA -20 ℃保存，其它组分可室温保存，未开封有效期24个月。

感受态细胞制备

1.活化菌种。-80 ℃保存的菌种在YPDA培养基平板上划线，30 ℃培养2-4天。

2.挑取酵母单菌落在YPDA培养基平板上划3-5 mm的短线，30 ℃培养2-4天。

3.待酵母单菌落长至直径2 mm时，把酵母细胞接种到3 mL YPDA液体培养基中，30 ℃过夜培养。

4.第二天转接到含有30-50 mL YPDA液体培养基的三角瓶中继续培养，待OD600达到0.4-0.5，3000 rpm离心5 min，弃上清。

5.沉淀用30-50 mL的无菌的去离子水悬浮。3000 rpm离心5 min，弃上清。

6.沉淀用1.5 mL 1 × LiAc（150 μL 10 × LiAc Solution加1350 μL无菌水）重悬后转移至1.5 mL离心管中，3000 rpm离心5 min，弃上清。

注意：10 × LiAc Solution经过pH缓冲，无需添加TE作为缓冲剂。

7.加入1 mL 1 × LiAc重悬，小体积转化按照每管100 μL分装，用于文库转化不分装。

8.3000 rpm离心5 min，弃上清，感受态细胞即制备完毕。

注意：制备好的感受态最好立即使用，在第8步离心前，室温放置不应超过5小时。

转化预混液配制：

酵母质粒转化：

1.将360 μL预混液加入1支感受态细胞中，反复吹吸沉淀，使酵母细胞彻底悬浮于预混液中。

2.30 ℃的水浴锅中孵育30 min，每10 min混匀一次。

3.（加入20 μL DMSO，可选）42 ℃的水浴锅中热击30 min，每10 min混匀一次。

4.12000 rpm离心15 s，弃上清液。

5.（可选步骤）用1 mL YPD Plus Liquid Medium重新悬浮，30℃摇床震荡培养30-60 min。12000 rpm离心15 s，弃上清液。

6.加入0.1-1 mL无菌去离子水或0.9%氯化钠溶液重悬沉淀，涂筛选培养基平板，30 ℃培养2-4天。

酵母文库转化：（需用15-50 mL离心管）

1. 将2520 μL预混液加入到感受态细胞（未分装）沉淀中，震荡使感受态细胞充分重悬。

2. 放置在30 ℃的水浴锅中孵育50 min，每10 min混匀一次。

3.（加入160 μL DMSO，可选）放置在42 ℃的水浴锅中热击30 min，每10 min混匀一次。

4. 3000 rpm离心5 min，弃上清液。

5.（可选步骤）用3 mL YPD Plus Liquid Medium重悬沉淀，30 ℃摇床震荡培养90 min，3000 rpm离心5min，弃上清液。

6.加入15 mL无菌去离子水或0.9% 氯化钠溶液重悬菌体，涂筛选培养基平板（50个平板左右），30 ℃培养2-4天。

注意事项

1.转化全程需无菌操作。

2.初次使用Carrier DNA，请把装有Carrier DNA的管子在沸水中煮沸5 min，然后立即放在冰上，用后-20℃储存备用。下次使用前在冰上解冻Carrier DNA。反复冻融3-5次后需重新变性Carrier DNA。

3.PEG溶液在低温环境下会析出，请于常温环境下完全溶解后使用。

4. 根据质粒浓度增减体积，增加酵母质粒的纯度和浓度可以提高转化效率。