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特点
- · cDNA合成和gDNA去除仅用20分钟完成
- · 即便是低丰度的转录本也能获得高产量的cDNA
- · 转录本的5'和3'端区域都可以进行cDNA合成
- · 无需设计RNA特异性引物或探针
产品详情
QuantiTect Reverse Transcription Kit通过方便快速的操作过程进行cDNA合成，并有效去除基因组DNA。应用gDNA Wipeout Buffer可高效去除RNA样本中的基因组DNA污染。QuantiTect Reverse Transcription Kit提供所有快速、高效逆转录所需的组分，包括Quantiscript Reverse Transcriptase、Quantiscript RT Buffer和独特的RT Primer Mix。合成的cDNA经过优化可用于real-time PCR，实现对mRNA转录本所有区域的靶分子进行可靠的定量检测。
性能
使用QuantiTect Reverse Transcription Kit，基因组DNA污染物可使用独特的gDNA Wipeout Buffer迅速有效的去除。去除基因组DNA对于准确的基因表达结果非常重要，而并不总是可以设计RNA特异性引物或探针。使用gDNA Wipeout Buffer可节省时间和费用，因为纯化RNA样品过程中或纯化后均无需另外采用DNase消化。
Quantiscript Reverse Transcriptase的高RNA亲和性配合Quantiscript RT Buffer可从各种RNA模板中获得高产量cDNA（见表“低丰度转录本可获得较高产量的cDNA”）。即使复杂的模板也能成功逆转录，如GC含量高或有复杂二级结构的模板。
| IL12A的CT值（低表达） | IL1RN的CT值（高表达） | |||
| Input RNA (ng) | QIAGEN | Supplier AII | QIAGEN | Supplier AII |
|---|---|---|---|---|
| 1000 | 30.9 | 32.0 | 23.1 | 24.9 |
| 100 | 34.2 | 35.4 | 26.3 | 26.6 |
| 10 | 37.8 | 46.8 | 29.7 | 30.3 |
| 1 | N.D. | N.D. | 32.4 | 34.5 |
使用不同量的RNA对IL12A和IL1RN 进行两步法Real-time RT-PCR分析。使用 QuantiTect Reverse Transcription Kit或是来自Supplier AII的试剂盒对总RNA逆转录。在ABI PRISM 7900上使用QuantiTect Probe PCR Kit对合成的cDNA进行分析，运用QuantiTect Gene Expression Assays分析IL12A或IL1RN。QIAGEN试剂盒得到的CT值更低，特别是培养基丰富的IL12A基因（加粗），表明cDNA产量更高。N.D.: Not detected.
RT Primer Mix包含有特别优化的oligo-dT和随机引物的混合物，使cDNA合成可从RNA转录本的各个区域起始，甚至可从5'区域开始。与其他供应商提供的试剂盒相比，QuantiTect Reverse Transcription Kit为real-time PCR分析提供高产量的cDNA，无需考虑待扩增目标序列位于转录本的哪个区域，检测低丰度的基因也具有更高灵敏度。同时，QuantiTect Reverse Transcription Kit也确保了real-time RT-PCR结果更好的重复性。
原理
QuantiTect Reverse Transcriptase是Omniscript和Sensiscript Reverse Transcriptases的新型混合物，对RNA具有高亲和性，可从各种含量的RNA（10 pg到1 µg）合成cDNA。与其他供应商提供的试剂盒相比，QuantiTect Reverse Transcription Kit为real-time PCR分析提供高产量的cDNA，无需考虑待扩增目标序列位于转录本的哪个区域。即使复杂的模板也能成功逆转录，如GC含量高或有复杂二级结构的模板。QuantiTect RT Buffer已经过优化，可与real-time PCR缓冲液兼容。
为获得准确的real-time RT-PCR基因表达分析结果，很重要的是仅扩增和检测cDNA。基因组DNA的干扰可通过设计横跨外显子/外显子边界的引物或探针避免。尽管如此，在某些特殊情况下（如：cDNA来自一个单外显子基因），起始RNA样品必须无基因组DNA。使用QuantiTect Reverse Transcription Kit，基因组DNA污染物可使用独特的gDNA Wipeout Buffer迅速有效的去除。使用gDNA Wipeout Buffer可节省时间和费用，因为纯化RNA样品过程中或纯化后均无需另外采用DNase消化。另外，不需要设计RNA特异性引物或探针。
操作流程
使用QuantiTect Reverse Transcription Kit可在20分钟内去除基因组DNA和合成cDNA（参见下图）。由于两个反应均在同一孵育温度并使用预混液构建反应，因此操作过程快速且方便。
QuantiTect Reverse Transcription Kit包括快速合成cDNA所需的所有组分。纯化的RNA只需简单地与gDNA Wipeout Buffer孵育，即可有效去除污染的基因组DNA。与其他的方法相比，使用Quantiscript Reverse Transcriptase、Quantiscript RT Buffer和RT Primer Mix制备的预混液可将RNA样品直接进行逆转录。使用Quantiscript Reverse Transcriptase，即使具有复杂的二级结构的RNA也可在低温下转录，确保RNA保持完整：整个反应都在42°C下完成，并在95°C失活。不需要RNA变性、引物退火和RNase H消化。
应用
QuantiTect Reverse Transcription Kit可从各种类型的起始样本中合成cDNA，以实现高效和高灵敏度的real-time RT-PCR。样本类型包括激光显微切割样本和活组织切片。
参数
| Features | Specifications |
| Applications | Quantification of (even low-abundance) transcripts |
| Sample/target type | RNA template |
| Enzyme activity | Reverse transcription |
| Real-time or endpoint | Real time |
| Reaction type | Two-step, cDNA production, genomic DNA digestion |
| Single or multiplex | Single |
| Mastermix | No |
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