WB上样缓冲液的选择和使用

       蛋白样品制备是免疫印迹（western blotting）的第一步,也是决定实验成败的关键步骤。在蛋白提取和定量后，就需加入蛋白上样缓冲液对蛋白进行处理，使蛋白样品能在接下来的电泳中分离。

        目前的蛋白上样缓冲液主要为还原（变性）蛋白上样缓冲液和非还原（非变性）蛋白上样缓冲液。

       一般的抗体只能识别抗原蛋白中的线性序列结构表位（一级结构），因此，为使抗体能够结合该表位，需要将蛋白样本进行变性，打开其折叠的空间结构(除抗体说明书特别标注之外，一般情况下，均使用变性蛋白样品)。还原（变性）蛋白上样缓冲液含有可完全消除蛋白高级结构的必需试剂。缓冲液中含有的 SDS 可断裂蛋白分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，同时 SDS 也与蛋白疏水区结合，由于 SDS带大量的负电荷，因此消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使其均带有相同密度的负电荷。缓冲液中的强还原剂 DTT 则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，分子被解聚成组成它们的多肽链。缓冲液中还含有甘油，确保上样后蛋白样本沉积在点样孔中。溴缓冲液中的酚蓝染料呈蓝色，且分子量比绝大部分蛋白质小，电泳中比其他蛋白质移动速度快，可监控电泳进程。加入还原（变性）蛋白上样缓冲液的蛋白样品最后需 100℃水浴 5 分钟变性。

       某些抗体识别的表位是非连续氨基酸构成的蛋白三维结构，此种情况则需要使用非变性蛋白样品进行电泳，抗体的说明书一般会标注。非还原（非变性）蛋白上样缓冲液不加 SDS和 DTT，蛋白样本也不需变性。

       博士德提供多种蛋白上样缓冲液，客户可依据实验需要进行选择。

一． SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液 2X（变性）/ 5X（变性）

       SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液适合用于变性 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳前的蛋白样本处 理。一般电泳每孔上样量为 20ul,样品蛋白量不小于 20ug，如蛋白样品浓度小，可使用 5 X 蛋白上样缓冲液；反之可使用 2X 蛋白上样缓冲液。

       使用：

       1. 按照 1 体积蛋白样品加入 1 体积 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液 2X（变性）即 1： 1 的比例混合；或 4 体积蛋白样品加入 1 体积 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液 5X（变 性）即 4：1 的比例混合，经 100℃水浴变性 5 分钟后即可上样，电泳。

       2. 通常电泳到当溴酚蓝染料到达凝胶的底端处附近即可停止电泳。

二． 双色蛋白上样缓冲液 4X（变性）

       双色蛋白上样缓冲液 4X（变性）适用于 SDS-PAGE 电泳前的蛋白样本处理。该优化 上样缓冲液可以保护蛋白样本在 SDS-PAGE 上样前加热处理和电泳过程中不被降解。该上 样缓冲液含有的两种示踪染料可监控电泳进程，分别是蓝色和粉红色，此外粉红色染料还可 以监控蛋白转膜效率。

       使用：

       1. 按照 1 体积蛋白样品加入 1 体积双色蛋白上样缓冲液 4X（变性）即 1：1 的比例 混合，经 100℃水浴变性 5 分钟后即可上样，电泳。

       2. 通常电泳到当染料到达凝胶的底端处附近即可停止电泳。

三． SDS-PAGE Tricine 蛋白上样缓冲液 2X（变性）

       SDS-PAGE Tricine蛋白上样缓冲液适合用于多肽和小蛋白SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝 胶电泳前的蛋白样本处理。

       使用：

       1. 按照 1 体积蛋白样品加入 1 体积 SDS-PAGE Tricine 蛋白上样缓冲液 2X（变性） 即 1：1 的比例混合，经 100℃水浴变性 5 分钟后即可上样，电泳。

       2. 通常电泳到当溴酚蓝染料到达凝胶的底端处附近即可停止电泳。

四. 蛋白上样缓冲液 2X（非变性）

       蛋白上样缓冲液 2X（非变性）适用于非变性蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳前的蛋白样本 处理。

       使用：

       1. 按照 1 体积蛋白样品加入 1 体积蛋白上样缓冲液即 1：1 的比例混合，即可上 样，电泳。

       2. 通常电泳到当溴酚蓝染料到达凝胶的底端处附近即可停止电泳。