超滤管的使用方法和注意事项

       超滤管采用垂直结构的膜减少浓差极化，加快了离心速度,大大了离心所需的时间，整个离心操作大概10-30分钟。倒转离心回浓缩后的样品保证极高的回收率(>90%的高回收率)，浓缩倍数可达25～30倍。内置低吸附的Ultracel-PL超滤膜，分别有3KD、10KD、30KD、50KD、100KD五种截留规格，是蛋白质溶液、细胞裂解液、组织培养液等生物样品浓缩、脱盐和缓冲液更换的理想选择。广泛应用于蛋白、抗原、抗体、酶、病毒和微生物等稀溶液或纯化后的蛋白质（如层析洗脱液）的浓缩、脱盐与纯化。

       蛋白浓缩和换Buffer通常使用的超滤管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超滤管（MWCO10kD）。也有其它型号的、不同体积大小和MWCO超滤管可选，视目的蛋白的分子量与浓缩前体积、浓缩目标体积而定。

技术指标：

       ①大起始样品处理量：15ml(吊篮转子)、12ML（35°固定角度转子），典型浓缩后终体积为200ul；

       ②内置超滤膜为Ultracel-PL纤维素超滤膜；

       ③适合50ML离心机转子；

       ④大离心力：吊篮式转子为4000×g；35°固定角度转子5000×g；

       ⑤尺寸：有效膜面积为7.6cm2，直径为35mm，长度为121mm；

       ⑥管壁上标有截留规格。

使用方法：

       1、选择合适的超滤管，主要考虑MWCO和浓缩体积，常见的是Ultra-15（10kD）。到底选择多大截留分子量比较合适呢？10kDa、 5kDa、还是30kDa？通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量为35kDa，就可以选择10kDa截留分子量的超滤 管。若目的蛋白分子量为10kD左右，则可以用截留分子量3kD的超滤管。认真阅读使用说明书，注意超滤膜对各种化学物质的耐受程度有所不同，表格中有。

       2、新买来的超滤是干燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全过膜，冰浴或冰箱里预冷几分钟。然后将水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超过管顶的白线为准。操作要轻，加入蛋白液前，超滤管需要插在冰上预冷。

       3、平衡。质量和重心二者都要达到平衡。注意转速和加速度不可太快，否则直接损坏超滤膜。开始离心超滤（离心机预冷至4度）。不同离心机的转速 rpm换算成g之后，有所不同。具体可参阅附件里的说明书。离心机的加速度调至低档，减小对膜的压力。注意，一定要等离心机达到目的转速之后，方可离开离心机，否则离心机出问题时，无法时间处理，后果不可预测！膜与转轴的方向根据说明书调整（角转离心机的情况是膜与轴垂直）。在实际使用中，一般转速开的比说明书里的要低，这样可以延长离心管的使用寿命。

       4、当浓缩到剩下1ml时，【取50ul国产Bradford溶液，加入10ul流穿，看有没变蓝色，以此判断超滤管是否漏掉蛋白。如果管漏了，将上层和流穿重新倒入新管中开始超滤。要判断是否漏管，用5mg/ml的BSA离心10min，再取流穿，跑蛋白胶或Bradford粗测】，继续加入剩下的蛋白液浓缩（在冰上操作，防止蛋白受热），直到所有浓缩液都加完为止。离心过程中注意是否发生蛋白沉淀，导致堵管。若发生沉淀，要确定沉淀的具体原因，是蛋白浓度过高还是Buffer不合适；前者可用多根超滤管同时超滤，降低浓度的办法解决，后者的方法是换不同的Buffer，直到蛋白不发生沉淀为止。

       5、前面几步用以浓缩蛋白，如果要换Buffer，在总蛋白液浓缩至1ml左右的时候，轻轻加入新的Buffer（经0.22um超滤膜超滤），再 浓缩至1ml左右，连续三次，后一次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定，一般不多于500ul，也有浓缩至200ul以内的情况。按照每次至少10倍 左右的体积浓缩算，三次达到1000倍以上，基本上可以达到换buffer的目的。

       6、取出终蛋白浓缩液的操作在冰上操作，用黄枪头（200ul）取，轻轻顺着边缘插入枪头，轻轻吹打、混匀蛋白液，注意不要碰到超滤膜，然后吸取浓缩液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的后一点浓缩液不必吸取，否则难度太大，有可能损坏超滤膜。后加入MilliQ水到超滤管中，没过 超滤膜，防止膜失水变干。

注意事项：

       若实验需要截留住目标蛋白，Millipore公司建议选择比目标蛋白大小至少小2-3倍纤维素超滤膜材质的超滤管。如果是聚醚砜超滤膜材质超滤管，则所选择超滤管规格大小比目标蛋白至少小4-5倍。