Y187-pHis2系统酵母单杂培养基套装+(含3-AT)

货号:YM1011
品牌:Coolaber
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YM1011-1Set 1 Set ¥1898.00 请登录 请登录

产品说明

Y187-pHis2 Yeast One-Hybrid Media Kit(酵母单杂培养基套装YM1010),含有用于Y187-pHis2系统酵母单杂交文库筛选的全套培养基,性价比更高。培养基以非常方便使用的铝箔袋形式包装,每个独立包装可以配制0.5 L的培养基。使用时仅需要将袋中的所有干粉倒入三角瓶或培养瓶中,加入0.5 L的ddH2O,然后121 ℃灭菌15分钟即可。无需称量和调整pH值。

Y187-pHis2 Yeast One-Hybrid Media plus Kit (YM1011)在试剂盒YM1010基础上增加了100 ml 3-AT溶液(2.5M,过滤除菌)。

 

实验材料

酵母菌株:Y187(缺陷基因型his3-200、trp1-901、leu2-3)

诱饵载体:pHis2-DNA(筛选标记Trp报告基因His)

文库载体:pGADT7-cDNA(筛选标记Leu)

 

实验步骤

一、转化诱饵载体(参考SK2400中质粒转化步骤)

1. YPDA平板培养划线,活化Y187酵母菌种;挑酵母菌落于液体YPDA培养基摇菌培养;

2. 制备感受态并将pHis2-DNA转化进入感受态细胞;

3. SD/-Trp平板检测转化结果。

 

二、自激活检测

1. 制备不同3-AT浓度梯度的SD/-His/-Trp平板(φ150mm),3-AT的浓度一般设定在50-100 mM之间,并设置不含3-AT的对照;

2. 将上述转化产物稀释到单克隆水平(OD值<0.002),涂板。

3. 筛选出适宜的3-AT浓度。(如某浓度3-AT平板上的菌落弱小且稀疏,与对照相比差距明显,且延长培养时间也不会再生长,即为理想的3-AT浓度)

 

三、互作筛选(具体步骤参考SK2400中文库转化步骤)

1. 液体SD/-Trp培养基培养诱饵菌株Y187(pHis2-DNA),制备Y187(pHis2-DNA)感受态细胞;

2. 将pGADT7-cDNA文库转入Y187(pHis2-DNA)感受态细胞;

3. 转化产物(取10μL稀释10倍,100倍,1000倍)涂SD/-Leu/-Trp平板各一块,用于计算转化效率;剩余转化产物全部涂SD/-His/-Leu/-Trp + X mM 3-AT(X为筛选所得浓度)平板50块(φ150mm),培养3-5天;

4. 挑取SD/-His/-Leu/-Trp平板上克隆,PCR(推荐SK2420)后测序鉴定;

5. 点对点验证。

 

培养基配制方法:

1. 一袋培养基干粉倒入三角瓶或培养瓶中,加0.5 L去离子水中溶解(琼脂冷水不溶)。

2. 无调整pH值,121 ℃高压灭菌15 min。

3. 液体培养基封好口避光、室温储存备用。

4. 固体培养基冷却到50 ℃左右倒入平板,室温凝胶,封口倒置4 ℃保存。

 

3-AT的使用方法:

1.计算所需平板的数量,配制培养基;

2.设置3-AT的浓度梯度;

3.灭菌筛选培养基,待培养基冷却到55 ℃左右,按设置浓度加入3-AT母液,摇匀后倒板;

4.标记每个平板的3-AT浓度,超净台冷却凝胶后,将转化产物涂板,28-30 ℃培养3-5天。

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