1. 载体处理及引物设计？

a. 载体的线性化方式有三种：双酶切、单酶切、反向PCR，优先选择双酶切。

b. 引物三部分：同源臂(15bp - 20bp，不计算酶切位点和残留碱基，GC含量40% - 60%)+ 酶切位点(根据实验需求保留或者删除) + 特异性引物(引物Tm值的计算不包括同源臂的序列)。

2. 平板上未长出克隆或克隆数目很少。

a.引物设计不正确：引物包含15 bp-20 bp同源臂(不计算酶切位点)，GC含量40%-60%。

b.线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量，或者比例不佳：尽量按照说明书中推荐的量和比例配制重组反应体系。

c.载体和插入片段不纯，抑制反应：未纯化DNA使用体积不应超过4μL(反应体系体积的1/5)；建议线性化载体、PCR产物进行凝胶回收纯化，纯化产物溶解在pH 8.0的ddH2O中。

d.感受态细胞效率低：感受态细胞的转化效率需大于107 cfu/μg。可进行简单检测，转化1 ng质粒，取1/10进行涂板，生长1000个菌斑，估算转化效率为107 cfu/μg；重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/6，否则会降低转化效率；选择克隆用感受态细胞(如DH5α/XL10)，不能选择表达感受态细胞。

3. 在负对照平板上长满很多菌落（几百个）

表明载体没有完全线性化：

a.你应该用DpnI酶消化处理PCR产生的线性化载体，以去除非线性化的模板；

b.如果线性化载体是酶切反应得到的，应该充分酶切（比如延长酶切时间），再将酶切产物切胶回收。

4. 多数克隆不含插入片段或含有不正确的插入片段。

a.PCR产物混有非特异扩增产物：优化PCR体系，提高特异性；胶回收PCR产物；鉴定更多的克隆。

b.克隆载体线性化不完全：可通过阴性对照检测载体是否线性化完全，优化酶切体系，提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物。

c.反应体系中混入了相同抗性的质粒：PCR扩增模板为环状质粒时，如扩增产物未纯化直接用于重组反应时推荐Dpn I消化，或者对扩增产物进行胶回收纯化。

5. 菌落PCR无条带。

a.引物不正确：推荐使用载体的通用引物进行菌检，或至少使用一条通用引物。

b.PCR体系或程序不合适：没有目的条带也没有空质粒条带，建议优化PCR体系、程序；或者提取质粒，以质粒做模板PCR验证；或者进行酶切验证。

重组失败：只有空质粒的条带，说明重组不成功，载体线性化不完全，建议优化酶切体系。