产品说明

Y187-pHis2 Yeast One-Hybrid Media Kit（酵母单杂培养基套装YM1010），含有用于Y187-pHis2系统酵母单杂交文库筛选的全套培养基，性价比更高。培养基以非常方便使用的铝箔袋形式包装，每个独立包装可以配制0.5 L的培养基。使用时仅需要将袋中的所有干粉倒入三角瓶或培养瓶中，加入0.5 L的ddH2O，然后121 ℃灭菌15分钟即可。无需称量和调整pH值。

Y187-pHis2 Yeast One-Hybrid Media plus Kit （YM1011）在试剂盒YM1010基础上增加了100 ml 3-AT溶液（2.5M，过滤除菌）。

实验材料

酵母菌株：Y187（缺陷基因型his3-200、trp1-901、leu2-3）

诱饵载体：pHis2-DNA（筛选标记Trp报告基因His）

文库载体：pGADT7-cDNA（筛选标记Leu）

实验步骤

一、转化诱饵载体（参考SK2400中质粒转化步骤）

1. YPDA平板培养划线，活化Y187酵母菌种；挑酵母菌落于液体YPDA培养基摇菌培养；

2. 制备感受态并将pHis2-DNA转化进入感受态细胞；

3. SD/-Trp平板检测转化结果。

二、自激活检测

1. 制备不同3-AT浓度梯度的SD/-His/-Trp平板（φ150mm），3-AT的浓度一般设定在50-100 mM之间，并设置不含3-AT的对照；

2. 将上述转化产物稀释到单克隆水平（OD值＜0.002），涂板。

3. 筛选出适宜的3-AT浓度。（如某浓度3-AT平板上的菌落弱小且稀疏，与对照相比差距明显，且延长培养时间也不会再生长，即为理想的3-AT浓度）

三、互作筛选（具体步骤参考SK2400中文库转化步骤）

1. 液体SD/-Trp培养基培养诱饵菌株Y187（pHis2-DNA），制备Y187（pHis2-DNA）感受态细胞；

2. 将pGADT7-cDNA文库转入Y187（pHis2-DNA）感受态细胞；

3. 转化产物（取10μL稀释10倍，100倍，1000倍）涂SD/-Leu/-Trp平板各一块，用于计算转化效率；剩余转化产物全部涂SD/-His/-Leu/-Trp + X mM 3-AT（X为筛选所得浓度）平板50块（φ150mm），培养3-5天；

4. 挑取SD/-His/-Leu/-Trp平板上克隆，PCR（推荐SK2420）后测序鉴定；

5. 点对点验证。

培养基配制方法：

1. 一袋培养基干粉倒入三角瓶或培养瓶中，加0.5 L去离子水中溶解（琼脂冷水不溶）。

2. 无调整pH值，121 ℃高压灭菌15 min。

3. 液体培养基封好口避光、室温储存备用。

4. 固体培养基冷却到50 ℃左右倒入平板，室温凝胶，封口倒置4 ℃保存。

3-AT的使用方法：

1.计算所需平板的数量，配制培养基；

2.设置3-AT的浓度梯度；

3.灭菌筛选培养基，待培养基冷却到55 ℃左右，按设置浓度加入3-AT母液，摇匀后倒板；

4.标记每个平板的3-AT浓度，超净台冷却凝胶后，将转化产物涂板，28-30 ℃培养3-5天。