产品简介

CPW酶解液、CPW洗液、CPW母液、CPW密度梯度离心液通用版产品介绍：

1. CPW为植物原生质体制备分离过程中常用的基础盐。

2. 不用的CWP含有不同的渗透压稳定剂，也有不同的用途。

3. 不同的植物样品，最适甘露醇浓度不一，请根据需求选择或者定做。

主要试剂

1. 20%蔗糖；

2. 13%CPW洗液：

   27.2mg/L 磷酸二氢钾（KH2PO4）

    101.0mg/L 硝酸钾（KNO3）

    1480.0mg/L 两个结晶水的氯化钙（CaCl22H2O）

    246.0mg/L 硫酸镁（MgSO4）

    0.16mg/L 碘化钾（KI）

    0.025mg/L 硫酸铜（CuSO4）

    13%W/V 甘露醇

    pH6.0

3. 酶液：

    1% 纤维素酶

    1% 果胶酶

    0.7M 甘露醇

    0.7mM 磷酸二氢钾（KH2PO4）

    10mM 两个结晶水的氯化钙（CaCl22H2O）

    pH6.8-7.0

4. 40% PEG液：

    40% PEG液（MW 1500-6000）

    0.3M 葡萄糖

    3.5mM 两个结晶水的氯化钙（CaCl22H2O）

    0.7mM 磷酸二氢钾（KH2PO4）。

主要设备

350目网，离心机，试管，离心管，吸管，显微镜，恒温水浴锅。

实验材料

1. 韭菜或大蒜叶；

2. 红辣椒。

实验步骤

植物原生质体的分离与纯化：

1. 将撕去表皮的植物叶片或花瓣置于酶液（pH 6.9,去表皮面接触酶液），在25℃黑暗条件下，酶解1～2小时。

2. 用350目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣。

3. 在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液。 红辣椒800转/分离心5分钟。加入3～4ml13%CPW洗液，相同条件下离心 ，弃上清液。加1ml13%CPW洗液悬浮。

4. 蔗糖漂浮法去除碎片。

蔗糖漂浮方法：

1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液约3ml，小心插入盛有原生质体悬液的离心管底部，缓缓将蔗糖溶液挤出，由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面(注意要有明显界面).

2) 离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处，

3) 用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离心管中，加入3～4ml13%CPW洗液离心（镜检决定是否需要离心），离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），收集沉淀，最终原生质体体积控制在0.5ML左右。

细胞融合：

1. 不同的原生质体各300μl与带盖离心管中，另加入300μl 40% PEG液，30℃水浴中温浴15min；

2. 融合液一滴于载玻片上(注意保持一定湿度，不能太干)，轻轻盖上盖玻片，显微镜观察。

实验结果：

用光学显微镜或倒置显微镜(高倍) 观察2-3个细胞靠近或融合的过程。（ 观察时注意不同程度的融合现象。通常分为五个阶段。①两细胞膜接触，粘连；②细胞膜形成穿孔；③两细胞的细胞质连通；④通道扩大，两细胞连成一体；⑤细胞完全合并，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。）